粉砕は揮発性化合物の回収に影響を与える

ハンドグラインダー、フードプロセッサー、コーヒーグラインダー、および制御設定が制限されたその他の粉砕方法は、研究室では標準的です。しかし、多くの対象生体分子は不安定であり、これらのプロセス中に消費される可能性があります。したがって、粉砕パラメータをほとんど制御できない機器では、化合物の発見と定量化で不正確な結果が得られる可能性があります。私たちは、粒子サイズ、粉砕時間、およびブレード速度が、機能性キノコにおける分析対象物の回収とその後の化合物濃度の測定に影響を与えるかどうかを調査しました。私たちは、ライオンズマンネ (Hericium erinaceus) をテスト基質として使用し、メッサーミル PULVERISETTE 11を使用して、さまざまな粉砕要因を正確に制御しました。これらのキノコの最も豊富な成分 (ロイシン、ミルセン、α-ヒドロキシイソ酪酸、2-アセチルブチロラクトン、2-ジエチルアミノエチルアセテート、およびマンニトール) を使用して、さまざまな粉砕手順による濃度を監視しました。

ライオンズマンマッシュルーム抽出物は、簡単なサンプル調製と抽出分析ワークフローを通じて調製されました。実験変数は、粉砕条件の違いを強調するために最小限に抑えられました。抽出物は、化合物の発見と定量化のために GCMS で調査されました。

サンプルの準備

真空乾燥したライオンズ マイン マッシュルームの丸ごとは、Nammex (ギブソンズ、BC) から提供されました。乾燥したライオンズ マイン マッシュルームの丸ごとを計量し、カミソリで切断し、メッサーミル PULVERISETTE 11で粉砕し、7 mm 粒子フィルターに通しました。材料のバッチは、メッサーミル PULVERISETTE 11にプログラムされたさまざまな速度で粉砕されました (粉砕パラメータは表 1 を参照)。粉砕された材料の各バッチからアリコートを採取して粒子サイズ分析を行い、別のアリコートを採取して液体抽出を行いました。

抽出

粉砕したライオンズマンネ（1.0g）を20mLシンチレーションバイアルに量り取りました。抽出は、HPLCグレードのメタノールと、0.5%（v/v%）ギ酸（Fisher Optima）を含む脱イオン水の1:1混合物20.0mLで室温で3時間行いました。抽出物をデカントし、アリコートを0.20µmナイロンシリンジフィルターでろ過してガラスバイアルに入れ、分析しました。

表1

Conditions	Mill Speed (RPM)	Mill Time (s)	Replicates
Slow-Short	2000	30	3
Slow-Mid	2000	60	3
Slow-Long	2000	90	3
Mid-Short	5000	30	3
Fast-Short	8000	30	3

表1. ライオンズマンのサンプル調製実験における粉砕パラメータ

GCMS分析

サンプルは、幅広い分析対象物を調査するために設計されたオーブンランププログラムを使用して、GCMS（Agilent Intuvo 9000 GC、5975 MSD）で分析されました（表2）。注入量は1.0 µLで、使用したGCカラムはHP-5ms超不活性30 mフューズドシリカカラムでした。適切な化合物はGCMS生データから抽出され、Agile 2ピーク識別アルゴリズムを使用して識別されました。化合物のフラグメンテーションパターン、抽出されたイオン領域、および保持時間は、MS-DIALを使用して抽出され、当社独自のスペクトルデータベースと比較して割り当てられました。

上記の実験は、キノコのサンプル調製において、ミル条件の正確な制御が重要であることを示しています。ライオンズマンマッシュルームサンプルは、ミル速度と時間の異なるパラメータに設定されたメッサーミル PULVERISETTE 11で粉砕され、その後液体抽出を受けました。抽出物の分析対象成分は、図1と2に示すように特定されました。私たちの結果は、ミル速度と時間がキノコ抽出物の分析対象成分の変化に対応していることを示しています。ミル設定がキノコからの分析対象成分の回収に直接影響を与えたことを示すことができました（図3と4）。4-グアニジノブチレートは食用キノコに含まれており、多くの種で知られている真菌代謝物です。^*1,*2Hericium erinaceusは、タンパク質含有量の3.3％がL-イソロイシンで構成されていることが知られています。^*3一方、私たちの知る限り、エスクリンとオフィオポゴノシドAは、これらのキノコではまだ報告されていません。これらの化合物の中で、ミル速度を下げ、ミル時間を短くすると、回収率が増加しました。これは、メッサーミル PULVERISETTE 11を使用すると、研究者がサンプル準備を最適化して最高の収量を確保できることを示しています。。

1. PubChem Compound Summary for CID 500, 4-Guanidinobutyric acid. National Center for Biotechnology Information https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/4-Guanidinobutyric-acid (2022)
2. Li, J., Wu, H., Wang, L., Huang, Y. & Wang, L. Key taste components in two wild edible Boletus mushrooms using widely targeted metabolomics. Biochemical Systematics and Ecology 96, 104268 (2021).
3. Aparicio-Razo, M. & González-Pérez, M. ANALYSIS OF BIOMOLECULES OF THE FUNGUS HERICIUM ERINACEUS THROUGH THE THEORY OF ELECTRON TRANSFER OF QUANTUM CHEMISTRY AND ITS RELATIONSHIP WITH THE PRIMARY AMINO ACIDS. 9, 139–147 (2020).

表2